细菌细胞培养皿

细菌细胞培养皿（如琼脂平板培养皿）是微生物学实验中常用的工具，用于细菌的分离、纯化、计数及药敏试验等。以下是其使用过程的详细步骤及注意事项：  

一、使用前准备  

培养皿选择  

根据实验需求选择合适材质（如玻璃或一次性塑料）和尺寸（如90mm、60mm）的培养皿。  

检查培养皿是否完好无损，避免使用有裂纹或污染的培养皿。  

培养基准备  

琼脂平板：将灭菌后的琼脂培养基（如LB琼脂、血琼脂）冷却至50-60℃，倒入无菌培养皿中，厚度约3-4mm。  

凝固：水平放置培养皿，待琼脂凝固（约30分钟），避免晃动产生气泡。  

标记：在培养皿底部用记号笔标注实验信息（如细菌名称、日期、操作者等），避免在盖子上书写以防混淆。  

无菌环境准备  

在超净工作台或生物安全柜中操作，提前开启紫外灯照射30分钟灭菌，操作前用75%乙醇擦拭台面。  

穿戴无菌手套、口罩和实验服，避免皮肤或衣物接触培养皿内部。  

二、接种操作  

接种工具准备  

根据接种方法选择工具：  

涂布法：无菌涂布棒（L形玻璃棒）。  

划线法：无菌接种环（镍铬合金或一次性塑料环）。  

打孔法：无菌打孔器（用于药敏试验）。  

接种环/棒需在酒精灯火焰上灼烧至红热，待冷却后使用（避免高温杀死细菌）。  

接种方法  

涂布法（适用于定量分析）：  

用移液器吸取100μL菌液，均匀滴加在琼脂表面。  

将无菌涂布棒平放在培养皿盖上，蘸取少量乙醇后点燃灭菌，冷却后轻压菌液并旋转培养皿，使菌液均匀涂布。  

划线法（适用于分离单菌落）：  

用接种环蘸取少量菌液，在琼脂表面划“Z”形或“S”形线条，每次划线后灼烧接种环并冷却，重复操作直至覆盖整个平板。  

打孔法（药敏试验）：  

在琼脂表面均匀接种细菌后，用打孔器在平板上打孔（直径约6mm）。  

向孔中加入不同浓度的抗生素溶液，培养后观察抑菌圈大小。  

封口与培养  

用无菌膜或培养皿盖密封，避免杂菌污染。  

根据细菌生长需求调整培养条件（如温度37℃、CO₂浓度5%、培养时间18-24小时）。  

需氧菌倒置培养（防止冷凝水滴落污染菌落），厌氧菌使用厌氧袋或罐培养。  

三、观察与记录  

菌落观察  

培养后观察菌落形态（大小、颜色、形状、边缘、透明度等），初步鉴定细菌种类。  

记录菌落数量（用于计数实验）或抑菌圈直径（药敏试验）。  

污染检查  

若培养皿中出现非目标菌落（如霉菌、酵母菌），可能为污染，需重新实验。  

四、使用后处理  

灭菌处理  

未使用的培养皿：若已开封但未接种，需重新高压蒸汽灭菌（121℃,15分钟）后丢弃。  

已接种的培养皿：  

含普通细菌：121℃高压蒸汽灭菌30分钟。  

含致病菌或高风险微生物：按生物安全要求进行化学消毒（如含氯消毒剂浸泡）或焚烧处理。  

废弃物分类  

将灭菌后的培养皿放入医疗废弃物专用袋，标注“感染性废弃物”后统一处理。  

五、注意事项  

无菌操作  

整个过程需严格无菌，避免说话、咳嗽或快速移动导致空气流动污染。  

接种环/棒冷却后接触菌液，防止高温杀死细菌。  

培养条件控制  

不同细菌需特定培养条件（如温度、气体环境），需提前查阅文献或标准方法。  

避免频繁开盖观察，防止杂菌污染。  

安全防护  

处理致病菌时需在生物安全二级实验室（BSL-2）操作，佩戴护目镜和防护服。  

实验后用肥皂洗手，避免交叉污染。